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Revista do Instituto Adolfo Lutz (Impresso)

Print version ISSN 0073-9855

Rev. Inst. Adolfo Lutz (Impr.) vol.71 no.4 São Paulo  2012

 

ARTIGO ORIGINAL/ORIGINAL ARTICLE

Fungos toxigênicos em camarões marinhos cultivados e potenciais toxigênicos das cepas isoladas de Aspergillus seção Flavi e seção Nigri

 

Toxigenic fungi in cultivated marine shrimp and the toxigenic potential of Aspergillus sections Flavi and Nigri strains

 

 

Rodrigo Maciel Calvet*; Maria Marlúcia Gomes Pereira; Amilton Paulo Raposo Costa; Regina Célia de Jesus Fialho; Maria Christina Sanches Muratori

Núcleo de Estudos, Pesquisa e Processamento de Alimentos, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Piauí

 

 

RIALA6/1515


RESUMO

O objetivo do presente estudo foi quantificar, isolar e identificar a micobiota toxigênica em camarões marinhos cultivados no litoral do Piauí. Foram selecionadas, randomicamente, quatro propriedades ("A", "B", "C"e "D"), de onde foram coletadas 84 amostras de camarão de três fases de cultivo: "I", "II"e "III". A contagem de fungos foi realizada em ágar dicloran rosa de bengala cloranfenicol. As colônias isoladas de Aspergillus e Penicillium spp foram transferidas para tubos contendo ágar extrato de malte. As contagens de fungos nas amostras de camarões coletadas variaram de 1,85 a 2,73 UFC/g log10 e não diferiram entre si em todas as fases de cultivo. Foram isoladas 64 cepas de fungos, e os gêneros mais prevalentes foram Aspergillus (34,4%) e Penicillium (25,0%). Foram identificadas dezoito cepas do gênero Aspergillus. Duas cepas de A. ochraceus e cinco cepas de A. agregados niger foram produtoras de ocratoxina A. Uma cepa de A. flavus produziu aflatoxina B1, B2, G1 e G2, respectivamente, nas concentrações de 14,8 ng/g, 4,3 ng/g, 2,6 ng/g e 1,1 ng/g, e foi classificada como A. flavus atípico. Os camarões cultivados no litoral piauiense, quando recentemente capturados, apresentaram baixas contagens fúngicas em todas as fases de cultivo.

Palavras-chave. Litopenaeus vannamei, fungos toxigênicos, Aspergillus, carcinicultura, micotoxinas.


ABSTRACT

The aim of this study was to isolate and to identify the toxigenic mycobiota in marine shrimp raised in Piauí coast. Four farms were randomly selected ("A", "B", "C"and "D"), from whence eighty-four shrimp samples of three farming stages "I", "II"and "III" were collected. The fungi count was done on dichloran rose bengal chloramphenicol agar. The isolated Aspergillus and Penicillium spp colonies were transferred into tubes containing malt extract agar. The fungi counts in shrimps samples ranged from 1.85 to 2.73 CFU/g log10, and they did not differ between them at all of the cultivation stages. Sixty-four fungi strains were isolated; and Aspergillus (34.4%) and Penicillium (25.0%) genus were mostly prevalent. Eighteen strains of Aspergillus genus were identified. Two A. ochraceus strains and five strains of A. niger aggregate were ochratoxin A producers. One A. flavus strain produced aflatoxin B1, B2, G1 and G2 in concentrations of 14.8 ng/g, 4.3 ng/g, 2.6 ng/g and 1.1 ng/g, respectively, and it was classified as atypical A. flavus. When freshly captured, the shrimps raised in Piauí coast showed low fungal counts at all of the cultivation stages.

Keywords. Litopenaeus vannamei, toxigenic fungi, Aspergillus, shrimp culture, mycotoxins.


 

INTRODUÇÃO

O Brasil produziu 80.000 toneladas de camarão em 2010, dos quais 78.399 toneladas foram absorvidas pelo mercado interno1. O Piauí foi um dos estados que contribuiu para essa produção e, em 2006, garantiu o oitavo lugar no ranking nacional em produtividade. A carcinicultura marinha foi introduzida no Piauí na década de 1980 e somente a partir da década de 1990, o Litopenaeus vannamei foi introduzido na região, tornando-se um marco para a carcinicultura piauiense2.

Entretanto, contaminações bacterianas, virais e fúngicas podem comprometer o desenvolvimento do setor, afetando diretamente a qualidade do produto final. Fungos são amplamente distribuídos na natureza e por esse motivo podem ser usados como parâmetro na avaliação microbiológica, determinando as condições higiênicas do ambiente de cultivo e do camarão cultivado, pois são utilizados como indicadores da qualidade higiênica3.

A pesquisa de fungos em alimentos é importante, pois algumas espécies são capazes de produzir micotoxinas e/ou causar deterioração4. No entanto, a RDC nº 12, de 2 de janeiro de 2001, não estabelece valores para a quantificação desses micro-organismos em camarões, ou para a maioria dos alimentos de origem animal processados5. Desse modo, as contagens fúngicas não são mais realizadas como rotina para a avaliação da qualidade de alimentos, especialmente em produtos de origem animal. Desta forma, produtos que apresentem uma contagem fúngica significativa podem ser comercializados, mesmo comprometendo a saúde do consumidor pela possível presença de micotoxinas produzidas por fungos contaminantes do alimento, caso os fatores como temperatura e umidade não sejam controlados6,7.

As micotoxinas são metabólitos secundários tóxicos, com baixo peso molecular, que possuem efeitos carcinogênicos, teratogênicos e imunossupressores, podendo causar convulsões, alucinações e hemorragias nos animais e seres humanos que consomem alimentos contaminados. Os gêneros de maior importância, por serem produtores desses metabólitos, são Aspergillus, Fusarium e Penicillium6-9.

Reis et al.10 obtiveram contagens de fungos filamentosos e leveduras em camarões frescos de água doce comercializados in natura sem gelo que variaram de 5,11 a 7,68 UFC/g. Eles justificaram esses resultados devido às variações de temperatura características das regiões tropicais e subtropicais e também à contaminação da água.

Lin e Dianese11 desenvolveram método para identificação de fungos micotoxígenos, que utiliza o ágar leite de coco, e baseia-se na produção de fluorescência azul-violeta e de pigmentação específica no meio de cultura quando a micotoxina está presente.

Yousefi et al.12 isolaram Aspergillus flavus em camarões tigre verdes (Penaeus semisulcatus) e verificaram que duas cepas produziram fluorescência no ágar coco sob luz ultravioleta. Posteriormente, a capacidade toxígena destes isolados foi confirmada por cromatografia líquida de alta eficiência12, apesar dos vários métodos utilizados para a detecção de fungos toxígenos que se baseiam na produção de micotoxina em extrato sólido ou líquido, extração da toxina com solventes orgânicos, purificação, concentração e detecção por cromatografia de camada delgada13.

Aflatoxinas são produzidas por cepas de Aspergillus flavus, A. parasiticus e A. nomius, que muitas vezes podem crescer em alimentos armazenados; estudos filogenéticos de A. flavus mostraram que eles se dividem em dois subgrupos. A linhagem “S” produz altos níveis de aflatoxinas, apresenta numerosos esclerócios pequenos, com média inferior a 400 µm de diâmetro, isolados e denominados como atípicos e também chamado var A. flavus parvisclerotigenus14.

A linhagem "L"produz menos esclerócios com tamanho maior que 400 µm de diâmetro e apresenta baixa produção de aflatoxina15,16. A maioria das cepas do grupo I produz aflatoxina B, e a maioria das cepas do grupo II produz tanto aflatoxina B como aflatoxina G17-19.

A carcinicultura é uma atividade em expansão no litoral piauiense e os camarões produzidos são congelados para distribuição no mercado interno e externo, para serem consumidos das mais diversas formas, inclusive crus e, portanto, as condições higiênicas e sanitárias devem ser avaliadas para verificar a segurança do produto final ao consumidor. Sendo assim, objetivou-se quantificar, isolar e identificar a micobiota toxígena de camarões marinhos cultivados no litoral do Piauí, bem como avaliar o potencial toxígeno das cepas isoladas de Aspergillus seção Flavi e seção Nigri.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Amostras

Foram selecionadas, randomicamente, quatro das catorze propriedades carcinicultoras existentes no litoral do Piauí (região delimitada entre 2º 55' 51,39''S - 2º 58' 04,31''S a 41º 20' 09,35''O - 41º 26' 33,52''O), identificadas para fins de pesquisa como ''A'',''B'', ''C'' e ''D'', onde foram coletadas amostras de camarão das três fases de cultivo: ''I'' (pós-larva8 - PL8 a PL18), ''II'' (PL18 a 90 dias) e “III” (90 a 120 dias), em delineamento fatorial 4x3 (quatro propriedades e três fases) representado por três amostras de 100 g de camarão, totalizando 84 amostras.

Após as coletas, as amostras foram armazenadas em sacos plásticos esterilizados Nasco Whirl-Pak® lacrados, identificados e transportados em recipientes isotérmicos contendo gelo reciclável até o Laboratório de Controle Microbiológico de Alimentos do Núcleo de Estudos, Pesquisa e Processamentos de Alimentos da Universidade Federal do Piauí.

Determinação da micobiota e identificação de espécies de Aspergillus

A contagem total de fungos foi realizada em ágar dicloran rosa bengala com cloranfenicol, de acordo com a metodologia recomendada por Pitt e Hocking9 para estimar micobiota total. A enumeração foi realizada através do método de dispersão em superfície: 25 g de cada amostra foram homogeneizados em 225 mL de água peptonada a 0,1%, por 30 min, em um agitador orbital. Foram realizadas diluições seriadas (10-1 a 10-3) e retiradas alíquotas de 0,1 mL inoculadas em duplicata. As placas foram incubadas a 25 ºC por cinco a sete dias. Após esse período, foram selecionadas placas contendo entre 10 a 100 UFC, conforme recomenda Dalcero et al.20. Os resultados foram expressos em UFC/g de amostra. As colônias de Aspergillus e Penicillium spp foram transferidas para tubos contendo ágar extrato de malte (MEA). A identificação de espécies de Aspergillus foi realizada de acordo com as chaves taxonômicas de Klich21, conforme segue: preparou-se uma suspensão de conídios a partir de cada cepa em 0,5 mL de meio constituído de 0,2% de ágar-ágar e 0,05% de Tween 80TM, distribuídos em tubo de hemólise previamente esterilizado a 121ºC por 15 minutos9. A seguir, introduziu-se a agulha de platina na suspensão de conídios, transferindo-os para três pontos equidistantes nas placas contendo Czapek Yeast Extract Agar (CYA), Malt Extract Agar (MEA) e Czapek Yeast Extract Agar 20% Sucrose (CY20S). Uma placa de CYA, MEA e CY20S foi incubada a 25 ºC, e uma placa de CYA a 37 ºC, todas por um período de sete dias. Após a incubação, visando à identificação das espécies, foram observadas as estruturas micromorfológicas e as características macroscópicas das colônias (diâmetro, textura, forma, aspecto da superfície e do reverso, pigmentação dos conídios e pigmento solúvel, produção e cor de exsudato).

Capacidade toxígena de Aspergillus

Potencial toxígeno dos Aspergillus da seção Flavi e da seção Nigri em Ágar Coco

O potencial toxigênico dos Aspergillus isolados foi avaliado pela inoculação em ágar leite de coco e incubação por sete dias a 25 ºC. Posteriormente, verificou-se a pigmentação produzida pelo fungo no meio de cultura e a fluorescência através de um cromatovisor com luz ultravioleta (UV) de 366 nm. A fluorescência característica da produção de micotoxina foi expressa com o símbolo (+) para positividade e (-) para negatividade11.

Produção de aflatoxinas por Aspergillus da seção Flavi

Foi realizado um pré-teste utilizando uma cepa de A. parasiticus (NRRL 2999) para avaliar sua capacidade toxígena, sendo que essa cepa produziu 0,5 µg de aflatoxina B1 por mL. Em seguida, todas as cepas de Aspergillus da seção Flavi isoladas foram testadas para produção de aflatoxina B1, seguindo metodologia recomendada por Geisen et al.22, conforme segue: as cepas foram cultivadas em placas de MEA a 28 ºC por sete dias. Após o período de incubação, o micélio foi transferido para um microtubo e acrescido de 1.000 µL de clorofórmio. A mistura foi agitada em microcentrífuga por 10 min a 1.400 rpm; o micélio foi removido e o extrato clorofórmico evaporado sob fluxo de N2. O resíduo foi redissolvido em 200 µL de clorofórmio. A detecção e quantificação de aflatoxina B1 dos extratos foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência, utilizando um cromatógrafo ShimadzuR, modelo Prominence, com detector de fluorescência modelo RF-10AXL SUPER, de acordo com a metodologia proposta por Trucksess et al.23. Uma alíquota de 200 µL do extrato da amostra foi derivatizada com 700 µL de ácido trifluoroacético:ácido acético:água (20:10:70, v/v/v). As separações cromatográficas foram realizadas em uma coluna de fase reversa (de sílica gel, 150 x 4,6 mm id., 5,0 µm de tamanho de partículas, Varian, Inc., Palo Alto, EUA). A fase móvel utilizada foi acetonitrila, metanol e água (17:17:66 v/v/v) a uma vazão de 1,5 mL.min-1. A fluorescência de derivados de aflatoxina foi gravada em comprimentos de onda de excitação e emissão de 360 nm e 460 nm, respectivamente. A curva padrão foi construída em diferentes níveis de padrão de AFB1, de 1,01 ng/mL, 2,02 ng/mL e 4,04 ng/mL (Sigma Aldrich® Co., St. Louis, MO USA, pureza > 99%). A toxina foi quantificada pela correlação das alturas dos picos do extrato da amostra com o da curva padrão (y = 0,0003x - 0,0077; R2 = 0,99). O limite de detecção do método analítico foi de 0,4 ng/g, com base na relação do sinal-ruído (3:1) e o limite de quantificação foi estabelecido como sendo 3 vezes o limite de detecção (1,4 ng/g).

Produção de ocratoxina A por Aspergillus da seção Nigri

Todas as cepas de Aspergillus da seção Nigri isoladas foram testadas para verificar a capacidade de produção de ocratoxina A (OTA), determinada seguindo a metodologia descrita por Bragulat et al.24: as cepas foram cultivadas em CYA a 28 ºC por sete dias. Três fragmentos do ágar foram retirados da área central da colônia, pesados e transferidos para um microtubo, acrescido de 1.000 µL de metanol. A amostra foi agitada em microcentrífuga por 10 min a 1.400 rpm, o sobrenadante filtrado e evaporado até a secura sob N2. O resíduo foi redissolvido em 1.000 µL de metanol. Os extratos foram analisados por cromatografia em camada delgada, conforme metodologia da AOAC Official Method 973.37 (Nesheim et al.25). A cromatografia foi desenvolvida em uma cuba contendo como solvente de corrida uma solução de tolueno:metanol:ácido acético (90:5:5). Posteriormente, foram observados sob luz UV (365 nm), determinando somente a positividade ou negatividade11 para OTA por comparação visual com um padrão de concentração conhecida (Sigma AldrichR Co., St. Louis, MO USA, pureza > 99%). Para a confirmação da presença de OTA utilizou-se uma solução alcoólica de bicarbonato de sódio, borrifada sobre a mancha. O limite de detecção foi de 0,5 µg/kg.

Análise Estatística

Os resultados foram transformados em log10 e realizou-se a análise de variância e aplicação do teste de SNK para comparação das médias de contagens fúngicas utilizando o Pacote Estatístico SIGMA STAT26.

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

As contagens fúngicas dos camarões das fazendas pesquisadas não diferiram entre si em todas as fases de cultivo (Tabela 1), caracterizadas em função do crescimento e ganho de peso dos animais.

 

Os camarões analisados eram recém-capturados, bem nutridos, sadios e possuíam boa imunidade. As baixas contagens fúngicas observadas nas diferentes fases de cultivo podem estar relacionadas a diversos fatores, dentre os quais o equilíbrio da microbiota externa do corpo do animal e o tempo decorrido entre a coleta das amostras e a análise. Porém, existe a possibilidade dos fungos presentes nos camarões multiplicarem-se após a despesca e durante o processamento do produto, caso seja armazenado em temperatura inadequada, pois, ao encontrarem condições ideais, os fungos possuem um importante papel no processo de deterioração, ocasionando perdas da qualidade do produto final e produção de micotoxinas conforme Internacional Comission on Microbiological Specifications for Foods4.

A legislação vigente não possui parâmetros para a quantificação de fungos e leveduras para pescado processado e expostos à venda5, por isso não é possível comparar os resultados encontrados aos padrões de referência. No entanto, as contagens fúngicas nos camarões das diferentes fases recém-despescados são relativamente baixas quando comparadas aos resultados de Reis et al.10, e a manipulação indevida, posterior à despesca, pode acrescentar novos micro-organismos contaminantes, assim como favorecer o desenvolvimento de fungos preexistentes.

Foram isoladas 64 cepas de fungos pertencentes a sete gêneros (Tabela 2) nas amostras de camarão das diferentes fases de cultivo, sendo que as espécies prevalentes pertenciam aos gêneros Aspergillus (34,4%) e Penicillium (25,0%). Reis et al.10 afirmam que camarões podem ser contaminados por fungos pela água do ambiente, no caso dos rios. A contaminação fúngica observada nos camarões cultivados no litoral piauiense pode ter ocorrido pela presença desses fungos na ração contaminada que se adaptou às condições de cultivo pela sua ampla difusão na natureza.

 

Foram identificadas dezoito cepas do gênero Aspergillus, pertencentes às seções Circundati, Terrei, Nigri e Flavi. As espécies isoladas estão descritas na Tabela 3. Destas, duas cepas de A. ochraceus e cinco cepas de A. agregados niger apresentaram resultados positivos para a produção de OTA em cromatografia de camada delgada. Por ser uma análise qualitativa, não foi quantificada a concentração da produção de OTA.

 

Uma cepa de A. flavus produziu aflatoxina B1, B2, G1 e G2 na concentração de 14,8 ng/g, 4,3 ng/g, 2,6 ng/g e 1,1 ng/g, respectivamente e foi classificada como A. flavus atípico14-19. Essa cepa apresentou todas as características morfológicas macroscópicas e microscópicas de um A. flavus diferenciando morfologicamente do A. parasiticus21. Esses dados assemelham-se aos estudos realizados por Saito e Tsuruta14, Geiser et al.15, Tran-Dinh et al.16, Pildain et al.17, Barros et al.18 e Perrone et al.19, que identificaram morfologicamente A. flavus atípicos do grupo II (Linhagem "S ") que são produtores de aflatoxinas B e G. Assim, a classificação e identificação molecular e filogenética dessa cepa torna-se necessária posteriormente, pois não há resultados relativos a essa variedade de fungos no Brasil, podendo ser uma variedade da seção Flavi, como afirmam Varga et al.27, que identificaram duas novas espécies da seção Flavi produtoras de aflatoxinas, e Gonçalves et al.28, que analisaram por biologia molecular cepas dessa seção isoladas de castanhas do Brasil.

Durante a despesca dos viveiros os camarões são transferidos para recipientes contendo água do canal de abastecimento, metabissulfito de sódio e gelo para manter a temperatura próxima a 0,0 ºC. Em seguida, esses depósitos são conduzidos para a indústria, onde os camarões são lavados com água clorada a 5,0 ppm, congelados a -35 ºC e armazenados a -20 ºC até expedição. A concentração de cloro utilizada é eficiente como bactericida, entretanto, não há comprovação da eficácia em fungos presentes em camarões.

Santos et al.29 e Veloso et al.30, ao testarem diferentes concentrações de metabissulfito de sódio e cloro em fungos do gênero Aspergillus spp e Penicillium spp isolados de diferentes etapas de beneficiamento de camarões, concluíram que concentrações de 6,0% de metabissulfito inibiram o crescimento in vitro desses gêneros, enquanto 5,0 ppm de cloro não inibiu o crescimento fúngico.

Assim, os sulfitos podem ser utilizados como fungicidas para fungos fitopatógenos produtores de esclerócitos31 e as temperaturas utilizadas durante o processamento dos camarões inibem o desenvolvimento dos fungos e sua consequente produção de micotoxinas32. As amostras de camarão analisadas apresentaram espécies de fungos micotoxígenos, e sua presença no produto não indica necessariamente a existência de micotoxinas, pois, para isso, é preciso que o fungo encontre condições ideais para seu crescimento6-7, portanto as amostras analisadas são consideradas seguras para o consumo.

As rações contaminadas por fungos micotoxígenos preexistentes na matéria-prima são consideradas como fontes de micotoxinas em carcinicultura, como afirmam Villarreal-Cavazos et al.33 e Calvet et al.34, detectaram níveis de aflatoxina B1 que variaram de 30 µg/kg a 360 µg/kg. Isto se deve ao fato das rações possuírem substratos potenciais para crescimento fúngico e produção desses metabólitos quando são armazenadas e expostas a fatores ambientais. Os fungos também podem contaminar os camarões cultivados, interferir na vida de prateleira pela sua capacidade proteolítica e consequentemente diminuir a qualidade do produto final.

No entanto, não existem padrões referenciais quanto à prevalência de fungos micotoxígenos em alimentos, necessitando um aprofundamento nas pesquisas com intuito de verificar a potencialidade dessas espécies, a possível presença de micotoxinas em camarões cultivados e os danos que podem causar para os consumidores do produto final.

Concluiu-se que os camarões cultivados no litoral piauiense, quando recém-capturados, apresentaram baixas contagens fúngicas em todas as fases de cultivo e os fungos prevalentes pertenceram aos gêneros Aspergillus spp e Penicillium spp. Também foram isolados os gêneros Trichoderma spp, Cladosporium spp, Fusarium spp, Alternaria spp e Curvularia spp.

As espécies de A. ochraceus e A. agregados niger isoladas em camarões eram produtoras de OTA.

Foi isolada uma cepa de A. flavus atípica do grupo II (Linhagem "S") produtora de aflatoxina B1, B2, G1 e G2 com diferenças macroscópicas e microscópicas do A. parasiticus, que necessitará, posteriormente, de uma identificação molecular para saber se não é uma cepa de A. parasiticus ou var A. flavus parvisclerotigenus14, pois até o momento deste estudo não há resultados relativos a essa variedade de fungos no Brasil.

 

AGRADECIMENTOS

Ao Conselho Nacional do Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq, pelo apoio financeiro.
À Fundação de Amparo à Pesquisa e ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Maranhão – FAPEMA.
Ao Laboratório de Micologia e Micotoxicologia do Instituto de Medicina Veterinária da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro.
Ao Laboratório de Micologia da Universidad Nacional de Río Cuarto.

 

REFERÊNCIAS

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*Endereço para correspondência: Núcleo de Estudos, Pesquisa e Processamento de Alimentos, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Piauí, Campus Ministro Petrônio Portela, CEP: 64049-550, Teresina, PI, Brasil. Tel.:/Fax: (86) 3215-5754. E-mail: rodrigocalvet@hotmail.com

Recebido: 23.11.2011
Aceito para publicação: 18.12.2012