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Revista do Instituto Adolfo Lutz (Impresso)

versão impressa ISSN 0073-9855

Rev. Inst. Adolfo Lutz (Impr.) vol.71 no.3 São Paulo  2012

 

ARTIGO ORIGINAL/ORIGINAL ARTICLE

Utilização de caldo Bolton no enriquecimento seletivo em comparação ao plaqueamento direto na pesquisa de Campylobacter spp. em carcaças resfriadas de frango

 

Use of Bolton broth for selective enrichment and comparative analysis of its performance with direct plating methodology for isolating Campylobacter spp. from chilled chicken carcasses

 

 

Valeria de Mello MedeirosI*; Silvia Maria Lopes BricioI;Ana Luzia Lauria FilgueirasII;Maysa Beatriz Mandetta ClementinoI

ILaboratório de Microbiologia de Produtos, Setor de Alimentos, Departamento de Microbiologia, Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde, FIOCRUZ, Rio de Janeiro, RJ, Brasil
IILaboratório de Zoonoses Bacterianas, Setor de Campylobacter, Departamento de Bacteriologia, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ

 

 

RIALA6/1490


RESUMO

O objetivo deste estudo foi comparar o enriquecimento seletivo e o plaqueamento direto no isolamento das espécies termofílicas de Campylobacter spp. em 30 amostras de carcaças de frango resfriadas adquiridas em supermercados, feiras livres e abatedouros no município do Rio de Janeiro, no período de julho de 2009 a julho de 2010. Foi realizada a enxaguadura da carcaça com água peptonada tamponada a 1% para recuperação das bactérias. Para o plaqueamento direto, foram utilizados ágar carvão cefoperazone desoxicolato modificado e ágar campy-cefex. Para o enriquecimento seletivo, foi empregado o caldo Bolton em concentrações simples e dupla. Foi detectada a presença de Campylobacter spp. em 21 amostras (70%), sendo 6 (28,6%) de abatedouros (3 com Serviço de Inspeção Estadual e 3 sem inspeção), 8 (38,1%) de supermercados e 7 (33,3%) de feiras livres. Não houve diferença estatisticamente significativa entre os resultados obtidos nesses estabelecimentos. As 21 amostras positivas foram isoladas do plaqueamento direto, 2 (9,5%) foram isoladas também no caldo Bolton simples e nenhuma no caldo Bolton duplo. O plaqueamento direto foi considerado o método mais rápido e eficiente, e apresenta menor custo que o enriquecimento seletivo na recuperação de Campylobacter spp. em carcaças resfriadas de frango.

Palavras-chave. Campylobacter spp., caldo Bolton, mCCDA, Campy-Cefex.


ABSTRACT

This study aimed at comparing the use of selective enrichment and direct plating for isolating the thermophilic species of Campylobacter spp. from 30 samples of chilled chicken carcasses purchased in supermarkets, marketplaces and slaughterhouses in the Rio de Janeiro city, from July 2009 to July 2010. Chicken carcasses were rinsed out with 400 mL of 1% buffered peptone water for bacteria recovering. Charcoal Cefoperazone Deoxycholate agar and Campy Cefex agar were used for direct plating. Selective enrichment was performed employing Bolton broth in single and double concentrations. The presence of Campylobacter spp. was detected in 21 samples (70%), being 6 (28.6%) from slaughterhouses (3 with State inspection service and 3 without inspection), 8 (38.1%) from supermarkets and 7 (33.3%) from marketplaces. No statistically significant differences were found among the results obtained from different establishments. Of 21 positive samples, 2 (9.5%) were isolated from single Bolton broth and none of them was positive in double Bolton broth. Therefore, the direct plating was considered easier, faster and more cost-effective than the selective enrichment methodology for recovering Campylobacter spp. from chilled chicken carcasses.

Keywords. Campylobacter spp., Bolton broth, mCCDA, Campy-Cefex.


 

INTRODUÇÃO

Nas últimas quatro décadas, as espécies de Campylobacter spp. têm sido reconhecidas como patógenos emergentes e despontaram como importantes agentes de gastrenterites de origem alimentar em várias partes do mundo1. Dados de países desenvolvidos apontam que as infecções causadas por algumas espécies do gênero Campylobacter têm sido relatadas como uma das principais causas de gastrenterites em grande parte dos países europeus2. Nos Estados Unidos, ocorrem cerca de 2,4 milhões de casos por ano3.

O gênero Campylobacter pertence à família Campylobacteraceae e é constituído de bastonetes delgados, curvos espiralados, gram-negativos e microaerófilos. Não formam esporos, não são hemolíticos e possuem uma motilidade característica em forma de saca-rolhas, produzida por um flagelo polar em uma ou ambas as extremidades da célula4. As espécies do gênero Campylobacter estão amplamente distribuídas na natureza, e a maioria está apta a habitar o trato intestinal de animais de sangue quente, sendo encontradas frequentemente em aves domésticas, bovinos, suínos, ovinos, roedores, pássaros, cães e gatos5. Campylobacter jejuni, C. coli, C. lari e C. upsaliensis representam o grupo de bactérias denominadas termofílicas, devido à temperatura ótima de crescimento oscilar entre 42 °C e 43 °C, sendo que C. jejuni e C. coli constituem as espécies mais frequentemente isoladas de enterites humanas2,5.

A campilobacteriose no homem ocorre em decorrência da ingestão de alimentos impropriamente manipulados ou mal cozidos. A grande maioria dos casos ocorre de forma isolada, com eventos esporádicos, não caracterizando um surto4. Os frangos são os maiores reservatórios dessas bactérias, e as espécies termofílicas estão mais associadas à doença, por suportar a temperatura do trato intestinal das aves, que é em torno de 41 °C. A contaminação de carcaças de frangos em abatedouros e o consumo de alimentos à base de frango mal cozido, além da contaminação cruzada durante a manipulação de alimentos crus, são considerados os principais fatores de risco para infecções5,6,7.

A doença é caracterizada por diarreia aguda, dor abdominal e cólica, podendo ocasionalmente ocorrer diarreia sanguinolenta contendo leucócitos e muco. Calafrios, náuseas e febre também representam uma sintomatologia da doença, mas os vômitos são raros. Um fator agravante na transmissão da doença é que pacientes convalescentes podem continuar excretando o micro-organismo nas fezes durante duas semanas a um mês8. Infecções por C. jejuni podem levar a sérias consequências pós-infecciosas, dentre as quais se destaca a Síndrome de Guillain-Barré, que consiste em uma polineuropatia inflamatória desmielinizante, resultando em paralisia neuromuscular aguda2.

Esses organismos microaerófilos são mais exigentes e possuem crescimento mais lento que outros enteropatógenos bacterianos e requerem condições especiais de crescimento, uma vez que são sensíveis ao oxigênio, característica que dificulta o seu cultivo9. As células de Campylobacter spp. respondem ao estresse causado pela presença de oxigênio, temperatura baixa ou falta de nutrientes, mudando a sua morfologia para formas cocoides, entrando em um estado viável não cultivável e sendo incapazes de crescer em meios seletivos de isolamento, mas podendo ser transmitidas e causar infecção em humanos10,11. Três fatores são fundamentais para o seu isolamento: o uso de meios seletivos, a incubação em atmosfera de microaerofilia e a temperatura de 42 °C no isolamento primário12.

O uso de suplementos, como sulfato ferroso, metabissulfito de sódio e piruvato de sódio, aumenta a aerotolerância do micro-organismo por meio da redução dos componentes tóxicos derivados do oxigênio, como peróxido de hidrogênio, oxigênio simples e íons superóxido. Muitos meios seletivos contêm alguns ou todos esses compostos em concentrações variadas12.

Existem vários métodos descritos para a pesquisa de Campylobacter em alimentos, incluindo ou não etapas de enriquecimento seletivo seguido de inoculação em ágares seletivos13. A maioria dos meios de enriquecimento para Campylobacter contém uma base rica em nutrientes, antibióticos para inibir competidores e ingredientes para amenizar os efeitos tóxicos do oxigênio12. O Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods5 recomenda a utilização do plaqueamento direto e do enriquecimento seletivo com o caldo Bolton em concentração dupla, o Bacteriological Analytical Manual14 e a Norma ISO 10.272-1:200615 recomendam a utilização do caldo Bolton em concentração simples.

O objetivo deste trabalho foi comparar o isolamento de Campylobacter spp. por plaqueamento direto e pela utilização de enriquecimento seletivo com caldo Bolton em concentração simples e dupla em carcaças resfriadas de frango.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Amostras

Foram adquiridas trinta amostras de carcaças resfriadas de frango, de diferentes marcas comerciais oferecidas para consumo no Município do Rio de Janeiro, no período de julho de 2009 a julho de 2010. A coleta foi realizada no dia anterior ou no mesmo dia da análise, em três tipos de estabelecimentos comerciais: supermercados (n = 10), feiras livres (n = 10) e abatedouros (n = 10), sendo quatro com Serviço de Inspeção Estadual (SIE) e seis sem inspeção. No momento da coleta, as amostras encontravam-se dentro das especificações (temperatura, validade, embalagem) estabelecidas pela legislação vigente para esse tipo de produto, definidas pela Resolução RDC nº 259, de 20 de setembro de 200216, com exceção das amostras de abatedouros sem inspeção e as adquiridas em feiras livres, que não possuíam rotulagem e não estavam refrigeradas.

As amostras foram transportadas em recipiente isotérmico contendo gelo e mantidas entre 2–8 °C até o momento da análise. A análise das amostras foi realizada no Setor de Alimentos do Departamento de Microbiologia do INCQS/Fiocruz.

Preparo da amostra

A pesquisa de Campylobacter spp. foi realizada de acordo com a metodologia descrita no capítulo 31 do Compendium of Methods for the Microbiogical Examination of Foods5, com a inclusão do caldo Bolton em concentração simples14,15.

No preparo inicial da amostra, foi utilizada a técnica da enxaguadura com um volume de 400 mL de água peptonada 1% tamponada.

Plaqueamento direto

Foi realizado o plaqueamento por esgotamento em estria de uma alça bacteriológica diretamente da água da enxaguadura das amostras. Foram utilizadas placas em duplicata com os meios ágar Carvão Cefoperazone Desoxicolato modificado (mCCDA-Oxoid) e ágar Campy-cefex17 (BBL), e incubados em atmosfera de microaerofilia utlizando o gerador CampyGen (Oxoid) a 42 °C por 48 horas.

Enriquecimento seletivo

Foram utilizados 25 mL do caldo Bolton (Oxoid) em dupla concentração, com suplemento seletivo contendo cefoperazona, trimetoprim, vancomicina e cicloheximida e 5% de sangue lisado de cavalo adicionado de 25 mL da água da enxaguadura. Em paralelo, foi utilizado 45 mL de caldo Bolton em concentração simples com os mesmos suplementos seletivos, adicionado de 5 mL da água da enxaguadura. Após a incubação a 42 °C por 48 horas em atmosfera de microaerofilia, o crescimento de cada caldo foi semeado, com uma alça bacteriológica, em duas placas com os ágares descritos na etapa anterior.

Todas as etapas foram realizadas paralelamente com as cepas de Campylobacter jejuni INCQS 00262 ATCC 33560 (controle positivo) e Escherichia coli INCQS 00033 ATCC 25922 (controle negativo), obtidos da coleção de culturas do INCQS.

Identificação de Campylobacter spp.

Os isolados que apresentaram crescimento sugestivo de Campylobacter spp. foram submetidos à coloração de Gram e às provas bioquímicas de oxidase e catalase. A confirmação de gênero foi realizada pelo teste de aglutinação em látex utilizando o kit Dryspot Campylobacter (Oxoid).

Análise estatística

As diferenças estatisticamente significativas entre as amostras de supermercados (n = 10), feiras livres (n = 10) e abatedouros (n = 10) foram calculadas pelo teste de Cochran (bilateral) ao nível de significância de 0,05. A análise comparativa entre as técnicas de plaqueamento direto e enriquecimento seletivo e da recuperação entre os ágares mCCDA e campy-cefex foi determinada pelo teste de Fisher seguido do cálculo de Odds Ratio. Essas análises foram realizadas no programa Bioestat 5.0 (2007).

 

RESULTADOS

Isolamento de Campylobacter spp. por plaqueamento direto

O plaqueamento direto, a partir da água de enxaguadura, nos meios seletivos ágar campy-cefex e mCCDA, demonstrou a presença de Campylobacter spp. em 21 (70%) das carcaças de frango analisadas. Destes 21 isolados, 13 (62%) foram obtidas no ágar campy-cefex e mCCDA concomitantemente, 3 (14%) somente no campy-cefex e 5 (24%) somente no mCCDA (Tabela 1).

 

Isolamento de Campylobacter spp. por enriquecimento seletivo

Das 21 amostras contaminadas com Campylobacter spp., somente 2 (9,5%) foram obtidas a partir do caldo Bolton simples e nenhuma do caldo Bolton em dupla concentração (Tabela 1). A etapa de enriquecimento seletivo com caldo Bolton nas concentrações simples e dupla seguida de esgotamento em ágar mCCDA e campy-cefex apresentou abundante crescimento de microbiota acompanhante.

Identificação de Campylobacter spp.

A coloração de Gram demonstrou a presença de bastonetes Gram negativos, delgados e em forma de asas de gaivota nos 21 isolados, que também apresentaram a produção das enzimas catalase e oxidade. Os 21 isolados foram confirmados como Campylobacter spp. pelo teste de aglutinação em látex.

Análise estatística

Não houve diferença estatisticamente significativa entre as amostras de supermercados (n = 10), feiras livres (n = 10) e abatedouros (n = 10). Das 21 amostras analisadas que apresentaram contaminação por Campylobacter spp., 8 (38,1%) foram provenientes de carcaças coletadas em supermercados, 7 (33,3%) em feiras livres e 6 (28,6%) em abatedouros. Das 6 amostras positivas obtidas em abatedouros, 3 foram de estabelecimento com SIE e 3, sem inspeção. Em relação ao plaqueamento direto e enriquecimento seletivo, foi demonstrado que as técnicas são significativamente diferentes (teste de Fisher, p < 0,0001). O cálculo de Odds Ratio foi 30, ou seja, as chances de isolamento pelo plaqueamento direto foram 30 vezes superiores às chances de isolamento pelo enriquecimento seletivo. Na comparação da recuperação dos ágares mCCDA e campy-cefex, foi demonstrado que não houve diferença significativa entre os referidos meios seletivos (teste de Fisher foi de 0,6965, ou seja, p > 0,05).

 

DISCUSSÃO

A recuperação de Campylobacter spp. em carnes resfriadas de frango depende da sensibilidade da metodologia adotada. Neste estudo, a recuperação de Campylobacter spp. foi significativamente superior (p < 0,05) pelo método do plaqueamento direto em ágar campy-cefex e mCCDA, em relação ao enriquecimento seletivo. Enquanto a recuperação pelo plaqueamento direto detectou Campylobacter spp. em 70% (21/30) das amostras, o enriquecimento seletivo revelou a presença dos mesmos em apenas 6,6% (2/30). Resultado semelhante foi obtido por Medeiros18, que utilizou o plaqueamento direto em ágar mCCDA e o enriquecimento seletivo em caldo Bolton duplo e isolou 70% de Campylobacter spp. apenas por meio do plaqueamento direto. Outros autores também verificaram que a recuperação por plaqueamento direto em mCCDA foi significativamente superior (41%) comparada com o enriquecimento seletivo em caldo Bolton simples (24,2%)19.

Resultados contraditórios foram observados por Franchin et al.20, que conseguiram isolar Campylobacter spp. em 91,7% das amostras utilizando enriquecimento com o caldo Bolton em concentração simples, assim como Johnsen et al.21, que isolaram Campylobacter spp. em 100% das amostras de frango de corte analisadas utilizando o caldo Bolton seguido pelo isolamento no ágar mCCDA. Outro estudo, porém, demonstrou a presença de Campylobacter spp. em carcaças de frango pelos dois métodos, com exceção de duas carcaças que só apresentaram esses contaminantes após o enriquecimento em caldo Bolton12. Esse dado foi reforçado pela análise comparativa entre esses métodos, demonstrando que ambos foram homogêneos e sensíveis para detecção de Campylobacter spp. em amostras de carcaças de frango. Entretanto, devido à antecipação dos resultados em 24 horas, os autores recomendam a utilização do plaqueamento direto22.

Os resultados obtidos neste estudo revelaram a presença de crescimento abundante de outras bactérias acompanhantes após o enriquecimento em caldo Bolton simples e duplo, o que prejudicou a visualização de colônias típicas de Campylobacter spp. Outros estudos confirmaram essa observação ao demonstrarem o crescimento excessivo de Escherichia coli e outras bactérias intestinais, após a utilização do caldo Bolton, mascarando a visualização das colônias de Campylobacter nas placas de ágar mCCDA23,24. Esse grupo de pesquisadores levantou a hipótese de que o caldo Bolton contém quantidades limitadas de compostos seletivos, sendo insuficiente para inibir a microbiota acompanhante de Campylobacter spp. em amostras muito contaminadas, uma vez que Campylobacter spp. têm uma taxa de crescimento menor que outras espécies bacterianas e são considerados fracos competidores fora do nicho intestinal19.

No presente estudo, não houve diferença estatisticamente significativa entre os meios de isolamento utilizados. O mesmo foi observado em um estudo onde foram avaliados seis meios sólidos para detecção de Campylobacter e não foram verificadas diferenças significativas entre cinco deles, incluindo campy-cefex e mCCDA25. Os autores também observaram que a utilização de meios de isolamento contendo grande número de antibióticos como o ágar campy-line pode prejudicar a recuperação de Campylobacter spp.25.

Em relação aos locais de coleta, não houve diferença significativa no isolamento de Campylobacter spp. entre as amostras de feiras livres, hipermercados e abatedouros. Dados similares foram obtidos por outros autores a partir do isolamento de Campylobacter spp. em carcaças e miúdos de frango coletadas em abatedouros clandestinos, feiras livres e supermercados, e em sobrecoxas resfriadas provenientes de hipermercados e feiras livres, respectivamente26,27. Outra evidência foi a detecção de Campylobacter spp. em carne de frango oriunda de estabelecimentos contendo Serviço de Inspeção Federal ou Estadual28. Esses dados podem estar relacionados com os diferentes mecanismos de colonização e com a enorme variedade de fontes de Campylobacter spp.29. Outro fator que pode estar relacionado com esses dados é a presença de aves no abatedouro com penas e pele, contendo fezes devido à aglomeração durante o transporte. Essas aves carreiam micro-organismos para o ambiente de processamento, o que pode levar à contaminação cruzada. Esses são alguns dos fatores que podem justificar a detecção desses micro-organismos em diferentes tipos de produtos e estabelecimentos.

No que se refere à variabilidade na recuperação de Campylobacter spp., os resultados apresentados, acrescidos de dados da literatura, sugerem que os métodos de análise influenciam consideravelmente, uma vez que existem muitos fatores envolvidos no favorecimento e ou inibição do isolamento12,18-21. Percentuais superiores e inferiores àqueles encontrados nesta investigação têm sido relatados20,26,28,30. Fatores como a susceptibilidade às condições adversas como congelamento, aditivos, microbiota acompanhante e tensão de oxigênio podem interferir na recuperação de Campylobacter spp.30. Além disso, o aumento na concentração de cloro na água de processamento das aves, aliado à melhora das condições de higiene, promovem a diminuição da contaminação31,32. Por outro lado, algumas cepas podem apresentar resistência aos antimicrobianos usados na desinfecção e contaminar as carcaças durante o processamento33.

 

CONCLUSÃO

O método do plaqueamento direto em meios seletivos mCCDA e campy-cefex foi superior na recuperação de Campylobacter spp. em carcaças resfriadas de frango em comparação com o enriquecimento seletivo. Por isso, o plaqueamento direto oferece resultados mais rápidos e de menor custo para os laboratórios.

Não foi verificada diferença significativa no isolamento de Campylobacter spp. entre os ágares mCCDA e campy-cefex. Em relação à procedência, não foram observadas diferenças significativas quanto à presença de Campylobacter spp. nos três locais de coleta. O mesmo ocorreu em relação aos estabelecimentos com inspeção sanitária ou isento desse serviço.

 

AGRADECIMENTOS

Agradecemos o professor Sergio Alves da Silva pela valiosa colaboração na realização das análises estatísticas e ao Marcelo Luiz Lima Brandão pelas sugestões na finalização do artigo.

 

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*Endereço para correspondência: Laboratório de Microbiologia de Produtos, Setor de Alimentos, Departamento de Microbiologia, Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde, FIOCRUZ. Avenida Brasil, 4.365, Manguinhos, Rio de Janeiro, RJ, Brasil, CEP: 21040-900. Tel: (21) 3865-5161. E-mail: valeria.medeiros@incqs.fiocruz.br.

Recebido: 14.07.2011
Aceito para publicação: 16.05.2012