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Revista do Instituto Adolfo Lutz (Impresso)

versão impressa ISSN 0073-9855

Rev. Inst. Adolfo Lutz (Impr.) v.67 n.1 São Paulo abr. 2008

 

ARTIGO DE REVISÃO/REVIEW ARTICLE

 

Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos - benzo(a)pireno: uma revisão

 

Polycyclcic aromatic hydrocarbons - benzo(a)pyrene: a review

 

 

Miriam Solange Fernandes CarusoI,*; Janete AlaburdaII

IInstituto Adolfo Lutz, Divisão de Bromatologia e Química, Laboratório de Cromatografia.
IIInstituto Adolfo Lutz, Divisão de Bromatologia e Química, Seção de Química Biológica. Av. Dr. Arnaldo, 355, CEP 01246-902, São Paulo,SP/Brasil.

 

 

RIALA6/1146


RESUMO

Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) constituem um grupo de compostos contendo dois ou mais anéis aromáticos condensados. Estes compostos são formados, principalmente, pela combustão incompleta da matéria orgânica. Os estudos em cobaias têm demonstrado que muito desses compostos, incluindo o benzo(a)pireno (BaP), são carcinogênicos e mutagênicos, sendo também considerados potencialmente genotóxicos e carcinogênicos para os humanos. O BaP é um dos HPAs mais estudados e é utilizado como indicador da presença de outros HPAs. Esse composto é um contaminante de ampla distribuição ambiental, presente em diversas matrizes, como solo, água, ar e alimentos. Na presente revisão são abordados os aspectos gerais dos HPAs, especialmente do BaP, assim como as metodologias analíticas publicadas desde a década de 1960. São apresentadas as modificações nos diferentes métodos de extração e nos solventes utilizados, as quais têm resultado numa significativa redução de tempo de análise, de volumes de solvente e de custo. São também discutidas as técnicas cromatográficas empregadas para a quantificação desses compostos, como CLAE e CGMS.

Palavras-chave: benzo(a)pireno, técnicas analíticas, alimentos, bebidas, água.


ABSTRACT

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are a chemical group composed of more than one hundred organic compounds containing two or more condensed aromatic rings. They are produced by an incomplete combustion of organic material. Many of them, including benzo(a)pyrene (BaP), have shown to be carcinogenic and mutagenic in experimental animals, and these compounds have been regarded as potentially genotoxic and carcinogenic to humans. BaP has been the most commonly subject of study, and PAH compound has been used as an indicator of total PAHs contamination. The present review describes some general topics on PAHs, mainly BaP, including the analytical methodologies for its quantification, which have been reported since 1960. Modifications on different extraction methodology and solvents, which resulted in reduction of turn-around time, solvent volumes, and analysis cost are also discussed. Chromatography techniques for PAHs and BaP quantification, such as HPLC and GC-MS are commented.

Key words: polycyclic aromatic hydrocarbons, benzo(a)pyrene, analytical methodologies, food, beverage, water.


 

 

INTRODUÇÃO

Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos

Nas últimas décadas, a contaminação de alimentos por substâncias tóxicas tem sido objeto de intensas pesquisas. Diversas classes de compostos químicos de diferentes origens vêm sendo detectadas em alimentos e bebidas, dentre elas os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs)1-6.

Os HPAs representam uma família de mais de 100 compostos orgânicos, formados por carbono e hidrogênio, contendo 2 ou mais anéis aromáticos condensados. São formados, principalmente, em processos de combustão incompleta de matéria orgânica e encontram-se na natureza como contaminantes de solos, ar, água e alimentos1. Os HPAs são poluentes orgânicos de importância ambiental e de interesse toxicológico, pois muitos apresentam propriedades pré-carcinogênicas e/ou mutagênicas para homens e animais4,7.

Origem

Os HPAs são produzidos por combustão incompleta ou pirólise da matéria orgânica. A formação pirolítica de HPAs é bastante complexa e variável, dependendo das condições reacionais. O esquema mecanístico aceito para esta reação envolve a polimerização via radicais livres, em várias etapas, até a formação de núcleos aromáticos condensados7. A formação destes compostos depende de fatores como tipo da biomassa presente, quantidade de oxigênio disponível, pressão e, principalmente, de calor, pois a concentração de HPAs aumenta linearmente na faixa de temperatura de 400 a 1000ºC8.

Estudos revelam que os HPAs podem ser provenientes de várias fontes antropogênicas como queima de carvão, escapamentos de veículos, óleos lubrificantes usados em motores, fumaça de cigarro, dentre outras, bem como de fontes ambientais como erupções vulcânicas e queimadas espontâneas. A contribuição de fontes naturais é muito limitada, contribuindo com pequenas quantidades de HPAs, enquanto que as fontes antropogênicas representam o principal processo de emissão destes compostos2,3,9.

Propriedades físico-químicas dos HPAs

As propriedades físicas e químicas dos HPAs são amplamente determinadas pelo sistema de duplas conjugadas presentes nas estruturas desta classe de compostos. À temperatura ambiente todos os HPAs são sólidos e apresentam, comumente, altas temperaturas de fusão e ebulição, baixas pressão de vapor e solubilidade em água. Os valores referentes a estas duas últimas propriedades tendem a diminuir com o aumento da massa molecular7.

Alguns HPAs são semi-voláteis, porém, muitos deles podem ser transportados até longas distâncias e serem adsorvidos em material particulado10,11. HPAs com 2 ou 3 anéis aromáticos estão quase totalmente na fase de vapor; aqueles com 4 anéis encontram-se numa posição intermediária. Os HPAs com 5 ou mais anéis aromáticos são encontrados predominantemente em particulados (cinzas ou fuligens cujas partículas são menores que 2,5 µm)8.

Com relação à sua característica lipofílica, os HPAs tendem a se acumular em tecidos lipídicos de plantas e animais; com relação às plantas, estes compostos concentram-se mais na superfície (peles e folhas) do que nos tecidos internos10. Apesar da pouca solubilidade em água, os mesmos podem ser transportados em meios aquáticos, adsorvidos em partículas em suspensão, ficando posteriormente, depositados nos sedimentos11. Devido a habilidade em filtração de água e por não apresentarem capacidade de biotransformá-los, determinados animais marinhos, como ostras e mexilhões, acabam acumulando os HPAs em seus organismos12.

Os HPAs são quimicamente inertes, porém, quando reagem, participam de reações de substituição eletrofílica e de adição. No caso das reações de adição, os compostos formados tendem a sofrer reações de eliminação, regenerando a aromaticidade7.

Toxicidade

O interesse pelo estudo da contaminação por HPAs e seus derivados reside no fato de que muitos deles são potencialmente carcinogênicos e mutagênicos4,13. Os HPAs estão entre aqueles poluentes ambientais que apresentam atividade cancerígena e mutagênica, podendo provocar tumoração em animais e mutação em bactérias2.

A exposição humana aos HPAs pode ocorrer por diferentes vias, como inalação, pele ou por ingestão. A ação exercida pelos HPAs é ativada durante o seu processo metabólico, visando à formação de compostos hidrossolúveis para facilitar a sua excreção. O mecanismo de eliminação envolve a formação de epóxidos, seguidos de compostos polihidroxilados, os quais são mais solúveis em água, viabilizando a sua eliminação pela via urinária. Um destes intermediários pode reagir com a guanina do DNA e formar um aduto dando origem a processos de tumoração7.

Segundo a Agência Internacional de Pesquisas sobre o Câncer (IARC), os HPAs são classificados de acordo com a evidência de carcinogenicidade em humanos e em animais experimentais. A Tabela 1 apresenta a classificação de alguns HPAs de acordo com a evidência de sua carcinogenicidade14.

 

 

Incidência de HPAs nos alimentos

Os alimentos e bebidas são uma das maiores fontes de exposição humana aos HPAs. A ocorrência destes nos alimentos é influenciada pelas mesmas características físico-químicas que determinam sua absorção e distribuição em humanos2. Diversos estudos têm sido realizados comprovando a presença destes compostos em vários alimentos brutos ou processados, além de bebidas e águas1,15-18.

Os alimentos podem ser contaminados a partir de HPAs disseminados no meio ambiente (ar atmosférico, solo ou água) ou durante o processamento e cozimento. As principais etapas de processamento são secagem e defumação e as de cozimento são as que utilizam altas temperaturas, tais como aquelas que envolvem ações de grelhar, assar e fritar19. Em áreas distantes de centros urbanos e industriais, os teores de HPAs presentes nos alimentos não processados refletem a contaminação ambiental13.

Algumas pesquisas têm sido realizadas com o objetivo de se avaliar quais são os grupos de alimentos que mais contribuem na ingestão humana destes contaminantes. Diversos trabalhos relatam a ocorrência de HPAs em diversos tipos de alimento, incluindo óleos vegetais, margarinas, maionese, produtos defumados, chás, café, leite e produtos lácteos, cereais, frutas, vegetais, carnes, peixes e frutos do mar, entre outros15,16,18,20-23.

Na Inglaterra, em um estudo realizado em 1983, foi verificado que dentre os grupos de alimentos, o dos óleos e gorduras e o dos cereais foram os que apresentaram os maiores níveis de HPAs. Apesar do grupo de óleos e gorduras apresentarem os maiores teores de HPAs, o grupo dos cereais foi o que mais contribuiu para a ingestão diária devido ao seu alto consumo18.

Na Holanda, verificou-se a presença de 17 HPAs nos principais grupos alimentícios que fazem parte da dieta da população, sendo que a ingestão de açúcar e correlatos foi uma das maiores fontes de HPAs. Nestes produtos foi observada uma elevada concentração de criseno, equivalente a 36 µg.kg-1 15. Em uma outra pesquisa também realizada na Holanda, os autores observaram altos teores de HPAs em mexilhão e em repolho24. A estimativa da ingesta diária de HPAs foi de 1,1 a 22,0µg/pessoa/dia, sendo que 30% desse valor correspondeu aos HPAs com atividade carcinogênica.

Na Itália foi constatado que os grupos dos cereais, produtos lácteos, carnes, vegetais e frutas foram os maiores responsáveis pela ingestão de HPAs. A estimativa da ingestão foi de 3,0 µg/pessoa/dia com base em todos HPAs e de 1,4 µg/pessoa/dia para os carcinogênicos23.

No Brasil, a ingestão diária de HPAs foi estimada em 11 regiões, com base em valores médios de consumo per capta de alimentos e em dados analíticos dos níveis de HPAs totais e carcinogênicos; foram escolhidos os alimentos representativos da dieta destas regiões. As maiores concentrações de HPAs foram obtidas no grupo de óleos e gorduras, seguido pelos grupos de açúcares e vegetais. Os óleos e gorduras se destacaram como fonte de HPAs em 10 áreas estudadas, sendo que, somente em Belém, o grupo das carnes contribuiu de forma mais significativa para a ingestão diária desses contaminantes25.

No âmbito do Codex Alimentarius, a necessidade de estabelecimento de limites para HPAs em alimentos tem sido manifestada por inúmeros países. Em 1991, o benzo(a)pireno foi reavaliado pelo Comitê Conjunto FAO/OMS de Peritos em Aditivos Alimentares (JECFA), que recomendou a elaboração de estratégias por parte das indústrias e dos consumidores para minimizar a exposição humana a este contaminante. Na 64ª Reunião do JECFA, realizada em Roma, em fevereiro de 2005, este Comitê identificou 13 HPAs como sendo genotóxicos e carcinogênicos, sendo eles: benzo(a)antraceno, benzo(b) fluoranteno, benzo(j)fluoranteno, benzo(k)fluoranteno, benzo(a) pireno, criseno, dibenzo(a,h)antraceno, dibenzo(a,e) pireno, dibenzo(a,h)pireno, dibenzo(a,i)pireno, dibenzo(a,l) pireno, indeno[1,2,3-cd]pireno e 5-metilcriseno26.

A Tabela 2 apresenta os teores de HPAs totais em algumas amostras de alimentos e bebidas. A partir dos dados é possível observar como o processamento pode influenciar na contaminação dos produtos, uma vez que os que apresentam os maiores teores de HPAs são aqueles submetidos a processos que envolvem elevadas temperaturas como secagem, torrefação ou defumação. Nas infusões de chá e café as concentrações de HPAs são relativamente menores em função da baixa solubilidade destes compostos em água, ficando depositados nas folhas ou partículas do pó. As bebidas alcoólicas foram as que apresentaram os teores mais baixos de HPAs, provavelmente, porque a destilação favorece a eliminação destes contaminantes1,5,7,10,16,17,19,21,27,28.

 

 

Degradação

Os HPAs são quimicamente estáveis, mas são suscetíveis à oxidação e foto-degradação pela luz. As meias vidas no ar variam numa faixa de poucas horas a dias; já, no solo, estima-se que as meias vidas possam ser de vários meses a muitos anos9.

Os HPAs com 4 anéis aromáticos são biodegradáveis sob condições aeróbias e a velocidade de degradação diminui com o aumento do número de anéis. A biodegradação sob condições anaeróbias é lenta para todos os compostos. Normalmente, as reações acontecem pela introdução de dois grupos hidroxilas nos núcleos aromáticos, formando dihidrodióis intermediários. A degradação bacteriana produz cis-dihidrodióis intermediários, enquanto que o metabolismo dos fungos e mamíferos produz trans-dihidrodióis intermediários. Certos tipos de algas também podem degradar os HPAs9.

Benzo(a)pireno

Dentre os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, o benzo(a)pireno é um dos mais conhecidos e estudados. Segundo a recomendação da International Union Pure and Applied Chemistry, IUPAC, a grafia correta é benzo[a]pireno, enquanto que o Chemical Abstract adota benzo(a)pireno. Também são observados na literatura as seguintes formas: benzo(def)criseno; 1,2-benzopireno; 3,4-benzopireno; 6,7-benzopireno; alfa-benzopireno; benzo(alfa)pireno; 3,4-benzpireno; 3,4-benz(a)pireno; BaP e B(a)P4,9,29.

Breve histórico

O início dos estudos dos HPAs teve sua origem em 1931 com o isolamento do benzo(a)pireno (BaP) a partir do carvão e sua síntese no mesmo ano. Os primeiros dados referentes aos riscos ocupacionais e ambientais dos HPAs foram obtidos em 1922 pela demonstração de que extratos orgânicos de fuligem eram carcinogênicos em animais. Além da atividade cancerígena do extrato de material particulado ambiental, o BaP foi identificado em fuligem doméstica e posteriormente em material particulado ambiental. Em 1970, ele foi caracterizado como um agente cancerígeno de distribuição mundial, em ambientes respiráveis e como constituinte de aerossóis urbanos30.

Dentre os HPAs, o BaP tem sido o composto mais amplamente avaliado. Em fevereiro de 2005 a Comissão da Comunidade Européia, através do Regulamento (CE) nº 208 de 04 de fevereiro de 2005, estabeleceu níveis máximos para benzo(a)pireno em alguns alimentos, tais como: peixes, óleos e gorduras (2,0µg.kg-1); crustáceos, carnes e peixes defumados (5,0µg.kg-1); moluscos bivalves (10,0µg.kg-1) e alimentos infantis (1,0µg.kg-1)31. No Brasil, a legislação vigente somente determina que os aromatizantes/aromas de fumaça não poderão fornecer mais de 0,03µg.kg-1 de benzo(a)pireno no alimento final32 e estabelece limite máximo de 0,7µg.L-1 de benzo(a)pireno em águas potáveis33.

Características físico-químicas

O BaP possui a aparência de cristais amarelo-pálidos em forma de agulhas, fórmula molecular C20H12 e peso molecular 252,39. Apresenta baixa volatilidade, seus pontos de fusão e ebulição são 178,1 e 310-312ºC (a 10mmHg), respectivamente. Sua pressão de vapor (25ºC) é 2,13 x 10-5 e a constante de Henry (20ºC) 1,86 x 10-5. Sofre foto-oxidação quando exposto à luz solar ou radiação fluorescente. Reage com NO ou NO2 para formar nitroderivados; é oxidado pelo ozônio, produzindo benzo(a)pireno-(1,6 ou 3,6)-quinona9,13.

Como os demais HPAs, o BaP é lipossolúvel, apresentando coeficiente de partição octanol/água (log Kow) igual a 6,04 e solubilidade em água a 25ºC de 3,8µg/L13. Desta forma, em sistemas aquosos, o BaP tende a concentrar-se em sedimentos ou permanecer associado à matéria orgânica em suspensão9.

Toxicidade

O BaP é considerado um dos mais potentes agentes carcinogênicos em animais, além de embriotóxico e teratogênico14. Por esta razão, ele tem sido utilizado como indicador da presença de outros HPAs em amostras ambientais, alimentos e bebidas31.

Após ser absorvido por animais, o BaP é biotransformado no fígado por uma classe enzimática denominada citocromo P-450 monooxigenases. Nas células hepáticas, as reações catalisadas pela citocromo P450-monooxigenase se processam no compartimento celular composto por uma rede tridimensional de túbulos e cisternas interconectados, que vai desde a membrana nuclear até a membrana plasmática, isto é, no retículo endoplasmático. Estas conexões intracelulares permitem que, após as reações de biotransformação, os HPAs hidroxilados sejam eliminados da célula9.

A toxicidade do BaP é provocada por sua potente ação pró-carcinogênica uma vez que alguns dos seus metabólitos intermediários são intercalantes de DNA e, portanto, agentes mutagênicos/oncogênicos. Processos neoplásicos são claramente observados em fígado de peixes e mamíferos já após 6 h ao tratamento com concentrações de BaP da ordem de 250 ppb2.

Metodologia analítica para determinação de BaP e outros HPAs em amostras de alimentos, bebidas e águas.

A metodologia para análise de BaP ou outros HPAs em alimentos vem sofrendo modificações visando aumentar a eficácia dos métodos em relação à extração, sensibilidade e reprodutibilidade, entre outros parâmetros. A Tabela 3 traz uma revisão de diversos trabalhos científicos desde a década de 60 nos quais estão descritos os métodos mais utilizados para análise de BaP ou HPAs em alimentos, bebidas e águas, bem como as respectivas concentrações encontradas. A seguir, estão descritas as metodologias de extração e de quantificação de HPAs comumente utilizadas.

Métodos de extração

Extração líquido-líquido (ELL)

A ELL é uma das práticas mais utilizadas até os dias de hoje para isolar os HPAs das matrizes alimentares. Nas décadas de 1960 e 1970, a maioria dos trabalhos publicados relatava o emprego desta técnica; entretanto, de uma maneira geral, a metodologia era bastante complexa e demandava diversas etapas, que se alternavam em extração e purificação6,20,34-37. Em suas pesquisas, Howard e colaboradores6,20 adotaram estes procedimentos na análise de determinados alimentos defumados como peixes, carnes, embutidos, queijos e alimentos não defumados, como laticínios, vegetais, bebidas, óleos e gorduras. A maioria das amostras foi submetida à uma saponificação prévia com KOH metanólico sendo, posteriormente, efetuadas as seguintes operações: ELL com isooctano; purificação em coluna clássica de Florisil, tendo como solvente de eluição o benzeno; uma segunda ELL com H3PO4 e dimetilsulfóxido/isooctano; novamente purificação em coluna e separação dos analitos em cromatografia em papel e em camada delgada6,34,35. Os autores também fizeram uso de outros solventes na ELL, intercalando duas extrações com isooctano com uma combinação de etanol/água/acetona20. Na mesma linha metodológica, Manoski et al., em 1968, avaliaram a contaminação de diversos tipos de embutidos, além de bacon, churrasco de porco e de boi, carnes de frango e de peru e peixes defumados36.

A metodologia de extração adotada nos trabalhos anteriormente referidos envolve muitas etapas, o que demanda intensa manipulação dos analistas, alto custo pelo excessivo volume de solventes, em torno de 3000mL, e, principalmente, o manuseio de produtos tóxicos, como o benzeno. Atualmente, o uso deste solvente é desaconselhável devido às suas características cancerígenas38.

Em 1975, Grimmer e Böhnke37, propuseram uma metodologia que vem sendo bastante utilizada por diversos pesquisadores. Neste procedimento as matrizes eram divididas em dois grupos. Faziam parte do grupo I os alimentos que necessitavam ser saponificados por conterem proteínas e gorduras em sua composição, por exemplo, produtos de origem animal e vegetais; o grupo II compreendia todos os alimentos nos quais não havia necessidade de saponificação, como os açúcares, os óleos e gorduras. Apesar de envolver menos etapas, este método ainda empregava grandes quantidades de solventes, em torno de 2500mL, utilizados na ELL com ciclohexano, com dimetilformamida/água e novamente com ciclohexano. A etapa de purificação era feita em coluna clássica com ciclohexano37. Esta metodologia vem sofrendo várias alterações desde a sua publicação, sendo que atualmente o volume de solvente empregado é quase 1/6 desse total1,7,16,25,28,39-42.

Kolarovic e Traitler43, em 1982, apresentaram os resultados de uma pesquisa sobre a contaminação de óleos vegetais por HPAs, na qual foi utilizada a ELL, porém de uma maneira simplificada; as amostras eram dissolvidas em 400mL de ciclohexano e submetidas a duas extrações com 100mL de uma solução de cafeína-ácido fórmico e duas extrações com 250mL de ciclohexano, sendo que, devido a formação de um complexo cafeína-HPA, a extração é favorecida. A purificação era feita em coluna de sílica, tendo como eluente, 100mL de ciclohexano. Twominen et al40, em um estudo sobre a presença de HPAs em cereais, também adicionaram cafeína às amostras, todavia a metodologia de extração adotada foi aquela proposta por Grimmer e Bönke37.

A extração de HPAs utilizando partição com ciclohexano e purificação em coluna clássica, com mais alterações visando sua simplificação tem sido bastante empregada para diversas matrizes. Stijve e Hischenbeur44 analisaram aromas de fumaça, carnes defumadas, peixes, óleos vegetais, cafés, cereais, especiarias e chá. Kruijf 45 e Badolato et al46 empregaram-na em análises de café verde e torrado após saponificação com KOH metanólico, sendo que neste último trabalho, inicialmente, as amostras foram extraídas com acetona usando o extrator de Soxhlet. Este procedimento também foi utilizado por de Vos para avaliar a contaminação da dieta da população alemã por HPAs15. Igualmente, Kleijans et al. adotaram este método de extração para análise de whiskies47.

Na literatura é relatado, ainda, o uso de outros tipos de solventes para a ELL, como por exemplo, acetato de etila (frutas e vegetais)16, acetonitrila (bacon, arenque e queijo)48; hexano (ostras)49, ciclohexano/metanol/água (aroma de fumaça)50. É possível notar que há, por parte da comunidade científica, uma preocupação em optar pela utilização de solventes que atendam às características físico-químicas necessárias para análise de HPAs e que atinjam a máxima eficiência de extração com o menor volume possível.

Extração em fase sólida

Nos últimos anos, a extração em fase sólida (EFS) tem-se mostrado uma ferramenta útil na determinação de HPAs em alimentos e em bebidas em virtude da praticidade, reduzido tempo de análise e menor custo devido aos baixos volumes de solvente empregados. Sua maior aplicação, ainda, está relacionada à etapa de purificação dos extratos de analitos obtidos por ELL, ultrassom ou por outros métodos. A fase estacionária comumente usada para a limpeza é a sílica gel8,18,42,51,52, tendo sido relatado também, o emprego de Florisil para purificar extratos de carne e vísceras de porco, frango e pato53.

Diversos autores apontam a EFS como método de extração de HPAs em alimentos3,54-56. Barranco e colaboradores55, em um estudo que envolveu amostras de óleos vegetais comestíveis, avaliaram a eficiência de extração de seis tipos de fases estacionárias, C8, C12, C18, ciclohexil, fenil e aminopropil. Os melhores valores de recuperação, em torno de 94%, foram obtidos com o cartucho de C18 e hexano como eluente. Em 2004, García-Falcón et al.56 apresentaram os resultados da comparação entre dois métodos de extração para análise de HPAs em águas para consumo: EFS (cartucho de C18, eluição com 25mL de acetonitrila/água e 5mL de hexano) e microextração em fase sólida, MEFS (fibras de dimetilsiloxano, agitação com 40mL de água, por 40 minutos a 60ºC). Os autores concluíram que, dentre as duas técnicas avaliadas, a EFS apresentou as maiores porcentagens de recuperação (96%) e os menores limites de detecção; citaram também, que a MEFS necessita ainda de maior aprimoramento para aumentar a performance de extração.

Em 2005, Bettin e Franco3 utilizando a EFS avaliaram a contaminação por HPAs de 25 amostras de aguardente, obtidas a partir de cana queimada e não queimada; foram testadas diversas combinações de fase estacionária e solventes, chegando-se à conclusão que o melhor desempenho foi alcançado com cartuchos de C18, com eluição de 2mL de isopropanol e 2mL de acetato de etila, com uma porcentagem de recuperação superior a 90%.

Apesar de mais complexa, a análise de carnes por meio de EFS também foi possível. Wazecha et al54 conseguiram separar HPAs, azarenos e aminoazarenos utilizando três tipos de cartuchos, com empacotamento e solventes distintos. Na primeira extração, foi utilizada terra diatomácea e 50mL de diclorometano, na segunda, a fase empregada foi ácido propilsulfônico usando para eluição de 6mL de HCl 0,1M e 2mL de água; finalmente, na terceira extração foi escolhida a fase C18, com 20mL de hexano e 60mL de hexano/diclorometano (60:40).

Extração com ultrassom

A aplicação de ultrassom (US) para extração de HPAs foi uma das alternativas empregadas por alguns pesquisadores em substituição à ELL10,17,57. Joe et al.57, em 1982, obtiveram resultados satisfatórios para análise de HPAs em cevada malteada; utilizando extração com ciclohexano em aparelho de US e, após purificação em coluna de sílica gel/alumina, foi realizada uma ELL com dimetilsulfóxido e ciclohexano.

Alimentos não gordurosos como purê de batata, batata e pão torrado foram avaliados quanto à presença de HPAs. Para a extração empregou-se banho de US e como solventes éter etílico e diclorometano. Segundo os autores, uma das vantagens deste método é que este dispensa a etapa de purificação17.

Lin, Tu e Zhu10 utilizaram a técnica com sucesso para análise de folhas de chá verde, preto e jasmim. Os analitos foram extraídos por 30 minutos em aparelho de US, com 20mL de diclorometano; os extratos foram purificados em coluna clássica de sílica com eluição de 10mL de hexano.

Outros solventes também podem ser utilizados para extração conjunta com US como diclorometano/acetona10 e clorofórmio58.

Outros métodos de extração: Soxhlet, extração acelerada com solvente e com fluído super crítico

São poucos os trabalhos onde são citados os usos de extrator de Soxhlet, extração acelerada com solvente (EAS)19 e com fluído super crítico59 para análise de HPAs em água e alimentos. Chen et al., em 1996, efetuaram a extração destes compostos por Soxhlet em carnes e vísceras53; Voutsa e Samara utilizaram a mesma técnica para avaliação de vegetais (repolho, cenoura, alface, endívia e alho poró)60. Badolato e colaboradores, conforme citado anteriormente, também empregaram este procedimento no preparo das amostras de café verde e torrado46.

Em 1999, Wang et al. compararam a extração por Soxhlet com a extração acelerada com solvente (EAS) em amostras de carne de porco, salsicha e salmão defumados. Na EAS foi adicionado às amostras Na2SO4 anidro e C18 em célula de extração com diclorometano/acetonitrila sob pressão; as porcentagens de recuperação obtidas nos dois métodos foram similares, ficando em torno de 70% para 0,3 ppm19. É importante observar, porém, que o nível de concentração em que as metodologias foram testadas é muito elevado em relação aos valores apresentados pelas amostras, de uma maneira geral, na faixa de ppb.

Métodos de quantificação

Os primeiros métodos de quantificação de HPAs, bem como BaP, utilizavam espectrofotometria na região eletromagnética do ultravioleta das frações de HPAs extraídas por partição e separadas por cromatografia em papel e camada delgada. A identificação dos compostos era feita por comparação dos espectros de fluorescência e de ultravioleta dos extratos com os obtidos a partir das soluções padrão20,35. As recuperações obtidas para amostras de peixe, queijo e "frankfurter" defumados foram na faixa de 73 a 100% para concentrações de 2ppb6, enquanto que para diferentes amostras de produtos cárneos defumados as recuperações para BaP variaram entre 65 e 75% para concentrações de 1 a 4 ppb36. Em um trabalho sobre dieta total, as recuperações obtidas para BaP em diferentes alimentos fortificados a 2 ppb foram 75 a 88% para carnes, peixe e frango; 75 a 84 % para vegetais; 75 a 100% para bebidas e 75 a 100% para óleos e gorduras20.

A partir de 1970, a quantificação de BaP e outros HPAs começou a ser realizada por cromatografia a gás (CG) com detector de ionização de chama (DIC)37,43. Esta técnica continua sendo amplamente empregada, sendo que atualmente se utiliza, preferencialmente, o detector de massas (MS). Boas separações podem ser obtidas com colunas capilares de sílica fundida, o que permite a análise de misturas bastante complexas de HPAs. As fases estacionárias mais empregadas neste tipo de análise são as de metilpolisiloxanas25.

Grimmer e Böhnke analisaram 11 HPAs em alimentos defumados e óleos e gorduras empregando a técnica CG-DIC e coluna de 10m x 1,5-2mm empacotada com 5 % OV-101. O BaP apresentou tempo de retenção em torno de 40 minutos37. Em 1979, Lintas et al. publicaram um método para análise de BaP em alimentos defumados, cozidos e tostados por CG-MS. Usaram coluna de 2m x 3mm empacotada com 3% OV-101 em Chromosorb W-HP operando isotermicamente a 250°C, energia de ionização 20 eV e monitoramento do íon a m/z 252. As recuperações para BaP foram na faixa de 93 a 95%61.

A análise de óleos vegetais por CG-DIC e coluna capilar de 30m x 0,3mm com fase estacionária OV-17-SE-30 permitiu a resolução de 15 HPAs em cerca de 25 minutos de corrida. As porcentagens de recuperações para 5 HPAs ficaram na faixa de 66 a 97%, sendo que para o BaP foram de 95 a 97% com coeficiente de variação de 0,42 a 0,7343.

Os primeiros trabalhos empregando a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foram publicados no final da década de 70 e, atualmente, tem sido a técnica mais utilizada para a análise de HPAs e BaP em alimentos, sendo que a confirmação da identidade dos HPAs previamente quantificados por CLAE tem sido realizada por CG-MS. O uso da CLAE permitiu o desenvolvimento de métodos mais sensíveis, podendo-se obter limites de detecção e de quantificação inferiores a 1 ppb21,25,49,62.

A análise de BaP empregando a técnica CLAE é realizada em fase reversa com colunas de fase estacionária octadecilsilano (ODS ou C-18) e, geralmente, fase móvel água-acetonitrila. A detecção pode ser realizada por ultravioleta10,49,53,57,62,63 ou fluorescência28,42,46,52,64, sendo que esta última é mais amplamente utilizada. A eluição pode ser realizada em modo gradiente ou isocrático, sendo que para a separação e quantificação de misturas de HPAs o modo gradiente é recomendado.

Em um trabalho de avaliação de BaP em amostras de cachaça por CLAE-DFl, os autores obtiverem valores médios de recuperação em torno de 74,5% para concentrações de 0,6 a 3,0ppb e limite de detecção de 0,011ppb21. Na quantificação de BaP em amostras de óleos comestíveis, os valores de recuperação foram de 99,9% com coeficiente de variação de 2,8% para concentrações de 1ppb, o método apresentou limite de detecção de 0,07ppb e de quantificação de 0,14ppb65.

Em um trabalho de avaliação de BaP em amostras de peixes, camarões e frutos do mar enlatados utilizando a técnica CLAE-DFl, os limites de detecção e quantificação obtidos foram 0,005 e 0,017ppb, respectivamente, e os valores de recuperação de 88% para concentrações de 2,3ppb e 96 % para 4,5ppb, com coeficientes de variação de 6,7 e 2,9, respectivamente42. Para a quantificação de BaP em amostras de café por CLAE-DFl, os limites de detecção e quantificação forem de 0,03 e 0,10ppb, respectivamente, e recuperações entre 76 e 116% para a faixa de concentrações de 1,0 a 3,0ppb46.

Benzo(a)pireno em alimentos e bebidas

Vários estudos vêm sendo realizados com o objetivo de avaliar quais são os alimentos ou grupo de alimentos que mais contribuem na ingestão diária de BaP e/ou HPAs. Tem sido verificado que as fontes de exposição variam de acordo com o país e o respectivo hábito alimentar. Nos últimos anos, algumas dessas pesquisas indicam que os grupos formados pelos óleos e gorduras, cereais e açúcares são os que apresentam maiores níveis de contaminação1,15,18,22.

De acordo com decisão do Comitê Científico da Alimentação Humana, da Comunidade Européia, os níveis de HPAs nos gêneros alimentícios devem ser reduzidos a concentrações tão baixas quanto possível. Desta forma, através do Regulamento (CE) nº 208, de 04 de fevereiro de 2005, este Comitê determinou que se utilizasse o benzo(a)pireno como marcador relativo à ocorrência de outros HPAs cancerígenos e determinou limites máximos para este contaminante para alguns tipos de alimentos31; tais valores estão apresentados na Tabela 4.

 

 

Algumas pesquisas têm sido realizadas a fim de verificar a possível contaminação de bebidas alcoólicas por HPAs, dentre eles, o BaP. De um modo geral, os resultados de BaP obtidos têm sido relativamente baixos5,23,39,47,66. Isto pode ser verificado no trabalho de Swallow, onde o teor encontrado em rum escuro foi de 1ng.mL-1 39; em whiskies as concentrações de BaP situaram-se na faixa de 0,0013 a 0,0193ng.mL-1 47 e na pesquisa de Toisssant e Walker não foi detectada a presença deste contaminante (limite de quantificação: 1ng.mL-1)66. Em 2005, García-falcon e Simal-Gándara avaliaram a contaminação de vinho verde, vinho tinto, vinho do Porto, jerez, rum branco, aguardente de uva, brandy de jerez, whisky e ponche; os valores de BaP, em ng.mL-1, obtidos resultaram em abaixo do limite de detecção (0,0001) para vinho verde, sendo que as maiores faixas de concentração encontradas variaram de 0,3 a 10,3 para aguardente de uva e de 2,6 a 6,3 para brandy de jerez; as demais bebidas revelaram teores menores que 3,1ng.mL-1 5.

No Brasil, poucos são os trabalhos desenvolvidos com relação à contaminação de bebidas por BaP, porém, alguns têm verificado a ocorrência deste composto em cachaças. A maioria deles relata como possíveis fontes de contaminação a queima do canavial, que é uma prática bastante adotada durante a fase da colheita da cana3,28,41. Devido às conseqüências negativas que este procedimento acarreta ao meio ambiente, em 19 de setembro de 2002, foi sancionada a Lei nº 11.241, do Estado de São Paulo, a qual dispõe sobre a eliminação gradativa do uso do fogo como método depalhador e facilitador do corte da cana-de-açúcar. Os plantadores de cana são obrigados a reduzir essa prática e eliminar a queima da palha gradativamente até o ano de 203167.

 

CONCLUSÕES

Vários são os trabalhos publicados referentes à análise de HPAs e BaP em diferentes alimentos e, alguns, em bebidas. Nos últimos anos, também têm sido realizados estudos da ocorrência destes compostos em dietas totais.

A metodologia mais utilizada para a extração destes compostos é a saponificação, seguida da extração por partição e limpeza dos extratos utilizando cartuchos de extração em fase sólida. Para a quantificação, utiliza-se amplamente a CLAE com detecção de fluorescência e confirmação por CG-EM.

 

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Recebido: 01/06/2007 – Aceito para publicação: 03/04/2008

 

 

*Endereço para correspondência: Instituto Adolfo Lutz, Divisão de Bromatologia e Química, Laboratório de Cromatografia. Av. Dr. Arnaldo, 355 CEP 01246-902, São Paulo,SP/Brasil E-mail: micaruso@ial.sp.gov.br